斑马鱼基因敲低技术morpholino
MO，全称Morpholino Oligomer。是美国的AVI pharmacy在九十年代初开发的一种反义（Anti-sense）技术，其基本原理是把核苷酸上的五碳糖环用一个吗啉环（morpholino）取代，同时对原有的磷酸基团也做了改变。使得这样一个DNA分子类似物可以通过碱基配对的方式同RNA和DNA单链结合，但是由于结构的改变，使得整个分子不带有任何电荷，因此无法被任何酶识别（包括DNase和RNase），使得这类物质在细胞内有着极强的稳定性。
在此基础上，针对某一个基因的mRNA，设计一段反义的MO寡聚物，在细胞内这个寡聚物和RNAi一样，通过与mRNA结合，来阻断这个mRNA的翻译，使得某个基因的在表达水平上被阻断，继而达到敲低基因目的【1】。
图1 MO 原理示意图
相比RNAi等其他反义技术，MO有很多优点。比如，MO不会被任何酶所降解，在细胞内稳定性极强，而且对细胞无毒副作用，并且不会像人工合成的RNA一样，会激活细胞干扰素的分泌，激起免疫应答。
但是MO技术也有其缺陷，由于特殊的分子结构导致其不带有任何电荷，使得MO无法被细胞表面的任何受体所识别，同时和无法通过转染的方式来导入细胞（RNA或者DNA通过其自身的电荷，同转染试剂如脂质体或者PEI形成复合物，来导入细胞）。因此，要将MO分子导入细胞，只有通过物理损伤细胞膜的方式来实现。
目前的Morpholino产品可以分为两种，一种是结合在mRNA的ORF前端（起始密码子附近）阻止翻译的ATG MO。另一种是结合在pre-mRNA中外显子和内含子连接区域，通过阻断mRNA剪切来降低目的基因表达的splice MO。
图2 绿色荧光为荧光染料标记的神经元细胞
先天性巨结肠又称希尔施普龙病，是小儿常见的先天性肠道疾病之一，由于结肠缺乏神经节细胞导致肠管持续痉挛，粪便淤滞于近端结肠，近端结肠肥厚、扩张。该病为可遗传疾病，导致患者营养不良发育迟缓，胎便排出延迟，顽固性便秘腹胀以及伴发小肠结肠炎，若不及时治疗，可能导致死亡。
肠道神经系统建立相关基因被认为在先天性巨结肠病的发病过程中起关键作用。斑马鱼肠道发育和人肠道发育较为相似，因此常常用斑马鱼研究人类肠道相关疾病。ihh （Indian hedgehog） 基因是肠道神经系统发育的关键基因，研究人员利用MO技术敲低斑马鱼胚胎中ihh基因的表达，发现敲低该基因后会导致斑马鱼胚胎的一系列发育异常，包括躯干卷曲，眼睛发育减缓，面部发育畸形，鱼鳔发育异常，肠道神经细胞明显减少等。MO技术的应用让研究人员易于获得基因敲低的斑马鱼胚胎，从而加快基因功能的研究 【2】。
图3 原位杂交显示胸腺发育[3]
在造血过程中，细胞增殖、分化和凋亡之间的平衡受到严格调控，以维持体内平衡。这些过程的失衡会导致不受控制的增殖和白血病。磷酸酶和紧张素同源物（PTEN）是参与调控这种平衡的分子途径之一，也被认为是肿瘤抑制因子之一。N-myc downstream-regulated gene 1b (ndrg1b) 和 fam49ab 可以拯救pten敲除的表型，在淋巴的发育过程中起到关键作用。
单独注射fam49ab的mRNA和ndrg1b的MO不会导致明显的胸腺发育异常，但是同时注射fam49ab的mRNA和ndrg1b的MO后胸腺发育明显延缓，说明同时过表达fam49ab和抑制ndrg1b表达会抑制胸腺发育【3】，MO技术的应用能让基因功能的研究更便捷。
羿晟为您提供个性化基因Morpholino定制以及表型实验服务。
参考文献
【1】Eisen JS, Smith JC. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 2008 May;135(10):1735-43.
【2】Sribudiani Y, Chauhan RK, Alves MM, et al. Identification of Variants in RET and IHH Pathway Members in a Large Family With History of Hirschsprung Disease. Gastroenterology. 2018;155(1):118-129.e6.
【3】Li RA, Traver D, Matthes T, Bertrand JY. Ndrg1b and fam49ab modulate the PTEN pathway to control T-cell lymphopoiesis in the zebrafish. Blood. 2016 Dec 29;128(26):3052-3060.
