斑马鱼如何实现皮肤附属器发育调控的可视化？
皮肤附属器是胚胎发生中由表皮衍生而来，包括毛、皮脂腺、汗腺、指（趾）甲等，对维持正常的皮肤功能具有重要作用。皮肤附属物是典型的发育生物学研究模型，已被用于上皮细胞-间充质转化（EMT）信号互作如何形成组织并影响形态发生等研究，在生物医学和发育进化生物学中都极具意义。
鳞、鸟羽和哺乳动物毛发[1]
尽管皮肤附属物多种多样，但它们具有一个共同的特征:主要由角蛋白组成，在皮肤的最顶层产生，随着皮肤细胞向内移动形成一个坑而形成皮肤附属器。但是，鱼鳞却不是由角蛋白组成，而是由骨细胞组成的。不同物种的同源基因各自调控着皮肤附属器的形成，进化研究认为它们都是从同样的祖先附属物进化而来的，而且这个祖先附属物有可能是鱼鳞【1】。
脊椎动物主要类群皮肤附属器的简化系统进化树[1]
在这里，我们分享一个利用斑马鱼进行的皮肤附属器发育调控机制的研究，帮助大家了解斑马鱼在发育机制研究中的优势【2】。
通过对斑马鱼鱼鳞形成的整体（in-toto）细胞信号活动进行实时成像，可以研究鱼鳞的图案形成以及形态发生。利用EGFP标记sp7+指示鳞的成骨细胞生成并表现脊椎动物相似的皮肤发育模式，可以依据鱼鳞生长规律将斑马鱼鱼鳞发育分为2R/4R/6R/B期。
EGFP标记sp7+指示鳞的成骨细胞生成并表现脊椎动物相似的皮肤发育模式
sp7+：EGFP（黄绿色）；ARS（钙化的基质，洋红色）
Wnt/β-catenin信号对于斑马鱼鳞片发育至关重要
如果脊椎动物皮肤附属物和硬骨鱼鳞片来自一个共同的祖器官，那么可以预测Wnt/β-catenin信号对鳞片发育是必要的，就像脊椎动物的外胚层附属器一样。
验证Wnt/β-catenin信号对斑马鱼鳞片发育影响
sp7+:EGFP（黄绿色）；
7xTCF:mCherry（蓝绿色）
利用hs:dkk1转基因品系斑马鱼条件性表达Wnt/β-catenin信号抑制剂，在sp7:EGFP绿色荧光出现前抑制Wnt/β-catenin信号可以有效抑制鳞片形成。同时，7xTCF:mCherry指示的Wnt/β-catenin信号活性也受到抑制。
除了鳞片表型之外，抑制Wnt/β-catenin也阻止了鳍的生长和腹鳍线的形成(图A，D)，证明了这一途径也在鳍发育中发挥作用。dkk1过表达的鱼的体长与对照组一样，所以鳞和鳍的发育不良表型不是由发育普遍迟缓引起的（图E）。
如果Wnt/β-catenin信号是鳞片发育所必需的，那么Wnt/β-catenin信号则必须先于鳞片形态发生。双转基因鱼的活体成像显示，Wnt/β-catenin信号出现早于sp7:EGFP+出现（图F）。证明Wnt/β-catenin信号对启动鳞片发育是必需的。
斑马鱼鳞片发育需要Wnt/β-catenin和Eda信号的互作
Wnt/β-catenin信号受阻导致的鳞和鳍发育不良表型和Eda（Ectodysplasin, 外异蛋白）缺乏的表型非常相似，因此提出斑马鱼鳞片发育中Wnt/β-catenin和Eda信号存在互作的假设。利用Eda缺失突变体nkt品系进行研究。
验证鱼鳞片发育中存在Wnt/β-catenin信号与Eda信号的互作
抑制Eda信号，Wnt/β-catenin信号依然会在鳞片发生位置成行聚集，但却无法发育成鳞片，说明Wnt/β-catenin信号只能启动鳞片的发育，后期的精细化发育还需要Eda参与完成。原位杂交的结果也说明了这点。
相反，想要知道Eda信号是否需要Wnt/β-catenin信号。在2R期诱导hs:dkk1，并分析eda和受体edar的表达。dkk1过表达的鱼中，Wnt/β-catenin被抑制，edar的表达被强烈减弱，而eda表达持续存在（图E，F）。
条件诱导eda和edar错位表达，发现这些部位也会积累sp7:EGFP，产生异位鳞片。但是在没有Wnt/β-catenin信号的情况下，eda / edar诱导异位鳞生长被完全阻断(图G，H)。因此，Wnt/β-catenin和Eda信号在斑马鱼鳞片发育中缺一不可。
类似地，利用荧光标记的转基因斑马鱼和Fgf（Fibroblast growth factor信号，影响皮肤附属器生成）抑制剂、检测HH（Hedgehog）信号、过表达HH信号关键因子shha等，并剔除斑马鱼鳞片观察其再生，说明这些信号通路对鳞片产生的影响。
Fgf依赖的鳞片形成细胞的分化需要Wnt/β-catenin信号
HH信号对鳞的形态发生至关重要，且需要Wnt/β-catenin和Eda信号协作
鳞再生需要Wnt/β-catenin和HH信号
斑马鱼鳞片形成和表皮形态发生的分子互作机制示意图
综合验证得出，鱼鳞的发育需要Wnt/β-catenin、 Eda和Fgf信号的协同作用，这些调控元件和皮肤表皮内陷过程中HH信号依赖的细胞集体迁移有协同作用。
斑马鱼鳞片发育模型在人类毛发、牙齿疾病发病机制等方面的研究中极具优势，不仅如此，模拟其它人类疾病，对候选信号通路的关键因子进行荧光标记，也可使信号通路可视化。
[1] Dhouailly, Danielle et al. “Getting to the root of scales, feather and hair: As deep as odontodes?.” Experimental dermatology vol. 28,4 (2019): 503-508.
[2] Aman, Andrew J et al. "Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development." Elife 7(2018):e37001.
